生态环境保护资金

生态环境保护资金实验干货！磷脂脂肪酸 PLFA测定——气相质谱法

PLFA 是磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid）的英文缩写。PLFA 是构成活体细胞膜的重要组分,不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同的 PLFA‚,部分 PLFA 总是出现在同一类群的微生物中而在其它类群的微生物中很少出现,细胞死亡后数分钟到数小时内细胞酶水解和释放磷脂, PLFA 被降解,这是 PLFA 作为区分活体微生物群落标记的基础。目前磷脂脂肪酸（PLFAs）因其分布广泛、含量相对稳定、周转迅速以及对环境因素的变化敏感已广泛用于土壤微生物学研究。
01实验方法及原理磷脂脂肪酸是几乎所有活体细胞膜的主要成分，周转速率快且随细胞死亡而迅速降解，脂肪酸结构与种类多样，对环境因素敏感，分析结果重复性较好。 

02主要实验仪器
气相色谱串联质谱仪、恒温鼓风烘箱、涡旋混合仪、高速离心机、干式氮吹仪、恒温震荡水浴锅、过柱装置；

03实验步骤
土样冻干：称取土壤 8.00g（凋落物0.1g）于50ml离心管中，冰冻过夜，随后放入冻干机冻干。取出冻干土样，加入12mL 提取液（甲醇：氯仿：柠檬酸 缓冲液=2：1：0.8），盖紧密封，摇晃混合，用黑色塑料袋裹住作避光处理；振荡 2h（振荡频率≥250 r/min）；7000rpm下离心10min，上清液转入分液漏斗；在离心管中再次加入10mL 提取液，涡旋混合30s，做避光处理，室温下往复振 荡1h；同上述步骤再次离心，上清液倒入分液漏斗；两次上清液合并。 

实验过程图片

分液漏斗中加入 5.8ml氯仿和柠檬酸缓冲液 5.8ml，涡旋混匀1min，静置 1h， 将下层转入另一收集管中，50℃氮气吹干；然后再加入2ml 氯仿，50℃氮气吹干， 于-20℃保存。

 组装好过柱装置，用5mL氯仿预处理硅胶柱；用向收集管中加 1.5ml氯仿 溶解样品，并转移到 SPE 萃取，分三次加入 20ml 丙酮，丢弃洗脱液，再分两次 加入甲醇 12ml，收集洗脱液于50℃氮气吹干。 

皂化：加入 1ml(NaOH：甲醇：蒸馏水=45g:150ml:150ml），涡旋混匀 20s， 盖紧盖子沸水浴 5min，震荡 10s，再置于沸水浴中 25min，自来水冷却。

 甲基化：加入 2ml（6N HCl：甲醇=325ml：275ml），涡旋混匀 20s，80℃水 浴 10min，自来水冷却。

萃取：分3次加入（正己烷：甲基叔丁基醚=325ml：275ml)，震荡 10min， 用滴管吸取上层正己烷于另一干净试管。

 洗涤：加入3ml(NaOH：水=10.8g:900ml)旋转震荡 5min，2000rpm 离心3min 转移上清液。氮吹收集液至干，取10mg/L 的十九烷酸甲酯（19：0）内标样100μL，溶解吹干后的物质后，转移到对应编号的色谱瓶内衬管，上机检测。